Направление на паразитологическое исследование крови на малярию

Мониторинг эпидемиологической ситуации по малярии на определенной территории осуществляют центры государственного санитарно-эпидемиологического надзора (центры Госсанэпиднадзора) и лечебно-профилактические организации. Он предусматривает выявление больных малярией, анализ данных о случаях малярии и степени маляриогенности территорий, проведение санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий и оценку их эффективности.

При выявлении больного малярией проводят его радикальное лечение и противомалярийные мероприятия в потенциальном очаге малярии, если случай завозной, и в активном очаге, если случай вторичный от завозного или местный.

Выявление больных и паразитоносителей.

Выявление больных и паразитоносителей проводят медицинские работники всех организаций здравоохранения, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности, а также лица, занимающиеся частной медицинской деятельностью, при всех видах оказания медицинской помощи (при медицинских осмотрах и обследованиях, обследовании доноров, подворных (поквартирных) обходах по эпидемиологическим показаниям путем опроса с термометрией и взятия препаратов крови у лиц, подозрительных на заболевание малярией и др.).

К группам повышенного риска заражения, требующим особого внимания как возможным источникам инфекции, относят: мигрирующие контингенты из эндемичных местностей (беженцы и вынужденные переселенцы, сезонные рабочие, специалисты по контрактам, коммерсанты, паломники, туристы, цыгане), военнослужащие, демобилизованные из российской армии после службы в эндемичных странах СНГ, экипажи морских и воздушных судов, совершающие рейсы в тропические страны и страны, где распространена тропическая малярия, служащие российских заграничных организаций в этих странах.

Больным малярией или паразитоносителем считается тот, у кого обнаружены малярийные паразиты при лабораторном исследовании крови методами паразитологическими, иммунологическими, молекулярно-диагностическими.

Показания для выявления больных малярией должны отвечать требованиям рационального обследования, полноты охвата и своевременности, т.к. чем раньше больной выявлен и пролечен, тем меньше вероятность осложнений болезни и эпидемических последствий для окружающих.

Медицинский работник обязан опросить больного о выездах в эндемичные по малярии местности; при подозрении на малярию необходимо взять периферическую кровь пациента, приготовить несколько препаратов крови (толстая капля и тонкий мазок) и доставить в лабораторию на исследование.

Препараты крови от подозрительных на малярию лиц исследуют в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических организаций, лицензированных и имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с возбудителями III и IV групп патогенности в установленном порядке. Все положительные и 10% от числа отрицательных препаратов направляют для контрольного исследования и подтверждения в областной, краевой или республиканский центр Госсанэпиднадзора.

Отрицательные препараты крови хранят в течение трех месяцев.

Контрольные исследования в период лечения и оценка эффективности лечения осуществляется паразитологическими методами.

При осуществлении паразитологической лабораторной диагностики возбудителей малярии следует руководствоваться методическими указаниями МУК 3.2.987-00 "Паразитологическая диагностика малярии". Иммунологическую и молекулярную (ПЦР) диагностику проводят в соответствии с инструкцией к диагностическим тестам.

Лечение больных и паразитоносителей.

Радикальное лечение следует проводить в условиях стационара. В период лечения больного малярией в стационаре препараты крови необходимо исследовать трехкратно (в 1-ый, 4-ый и последний дни) при трехдневной малярии и ежедневно при тропической - с 1-го по 7-й день от начала специфического лечения.

При исчезновении паразитов в пределах этого срока контрольные исследования крови проводят на протяжении 1 месяца с интервалом в 7 - 10 дней.

Центры Госсанэпиднадзора при выявлении больного малярией проводят эпидемиологическое расследование случая и обследование очага, санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия по предупреждению последствий завоза малярии.

Врач-паразитолог или эпидемиолог из центра Госсанэпиднадзора осуществляет надзор за правильностью и своевременностью выявления больных малярией и паразитоносителей в лечебных учреждениях здравоохранения, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности и лиц, занимающихся частной медицинской практикой. При этом следует обращать внимание на группы повышенного риска заражения. В медицинской карте гражданина, выезжавшего в эндемичные по малярии страны мира, делают соответствующую запись "выезжал в тропики", в анамнезе перечисляют страны и сроки пребывания, употребленные лекарственные препараты. При подозрении на малярию делают запись о дате взятия препарата крови (толстая капля и мазок) и результате исследования в лаборатории.

В лаборатории врач-паразитолог или эпидемиолог проверяют правильность наличие комплекта (стерильные предметные стекла, скарификаторы, краска по Романовскому - Гимза) для забора периферической крови и приготовления микропрепаратов, правильность регистрации препаратов крови в лабораторном журнале, сроки сообщения врачу, направившего больного на исследование, а также периодичность отправления всех препаратов с паразитами малярии и 10% от общего числа исследованных препаратов на контроль и подтверждение лабораторного результата в лабораторию территориального центра Госсанэпиднадзора.

При выявлении случая малярии, а также лиц, являющихся носителями возбудителей болезни, лечебно-профилактические организации, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности, а также лица, занимающиеся частной медицинской практикой, представляют информацию в территориальные учреждения госсанэпидслужбы и органы управления здравоохранением в течение 2 часов по телефону и затем в течение 12 часов посылают экстренное извещение по установленной форме в территориальные учреждения госсанэпидслужбы.

Органы и учреждения госсанэпидслужбы и органы управления здравоохранением субъектов Российской Федерации представляют информацию о случаях заноса или возникновения очагов болезней в федеральный орган исполнительный в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения в установленном порядке в соответствии с документами о внеочередных донесениях.

После получения центром Госсанэпиднадзора экстренного извещения из организации здравоохранения, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности, или от медицинских работников, занимающимися частной медицинской практикой, врач-паразитолог, эпидемиолог и энтомолог проводят эпидемиологическое обследование инфекционного очага, которое включает: сбор анамнеза, оценку сроков клинических и лабораторных исследований больного, опрос населения, подворный обход усадеб в сельской местности или домов в городских кварталах, решение вопроса о взятии препаратов крови у подозрительных на малярию лиц лечебно-профилактическими организациями, обследование мест выплода комаров и помещений, назначение дезинсекционных мероприятий. На каждый случай заболевания заполняют карту эпидемиологического обследования очага инфекционного заболевания и копию карты направляют в вышестоящий центр Госсанэпиднадзора в течение трех дней со дня обследования. Областные, краевые и республиканские центры Госсанэпиднадзора карту эпидемиологического обследования направляют в текущем месяце в федеральный орган исполнительной власти в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения и в ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского ММА им. И.М. Сеченова (Москва).

В случае госпитализации больного малярией в лечебно-профилактическое учреждение врач-паразитолог, эпидемиолог, госпитальный эпидемиолог проверяет условия, не допускающие передачу малярии в стационаре (одноразовый медицинский инструментарий, защита от залета малярийных комаров в помещения), а также кратность исследования крови у больного. В стационаре предусматривают неснижаемый запас противомалярийных препаратов для лечения больных трехдневной малярией (например, хлорохин, примахин или другие препараты, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке), тропической (например, мефлохин, хинин с тетрациклином, артемизинины или другие препараты, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке).

В очаге малярии по предписанию Главного государственного санитарного врача в субъекте Российской Федерации лечебно-профилактические организации проводят подворные (поквартирные) обходы 1 раз в 10 - 14 дней с санитарным просвещением населения, что способствует увеличению обращаемости жителей и своевременному выявлению больных малярией. Медицинские работники обеспечивают качественное взятие препаратов крови у выявленных больных с симптомами, не исключающими малярию, и доставку в лабораторию в тот же день, вместе с сопроводительным талоном, где указывают фамилию, имя, отчество, возраст, дату обследования, температуру тела больного и другие симптомы, послужившие поводом для обследования.

При наличии потенциальных источников инфекции в сезоне передачи малярии существует опасность заражения окружающих лиц, поэтому необходимо предварительное лечение лиц с симптомами малярии в очаге однократной дозой какого-либо гамотропного препарата (например, хлорохина, хлоридина, тиндурина или других, разрешенных к применению для этих целей в установленном порядке), если срочное лабораторное исследование препарата крови невозможно.

Санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия.

Врач-паразитолог, эпидемиолог совместно с энтомологом планируют комплекс противомалярийных мероприятий в соответствии с таблицей 2 и проводят организационные меры с учетом наличия или отсутствия местной передачи на маляриогенных территориях, где имеются природные предпосылки передачи малярии, и типа очага малярии.

При этом необходимо иметь следующие данные:

- демографическую структуру - численность и возрастной состав населения на начало текущего года, число усадеб или домов, квартир;

- пространственную структуру, отображенную на карте очага с указанием анофелогенных водоемов, мест проживания больных малярией, дорог;

- функциональную структуру очага за последние 3 года - классификацию очага, число больных по месяцам, возрастным группам, полу, контингентам;

- лечебно-профилактические мероприятия - охват населения активным и пассивным выявлением, паразитологическим или серологическим обследованием, лечением и химиопрофилактикой;

- противокомариные мероприятия, для чего необходимы результаты учета численности комаров (взрослых и личинок), паспорта водоемов, расчет количества инсектицидных и ларвицидных препаратов, автомаксов, числа бонификаторов, транспорта, средств защиты от укусов насекомых.

О проведенных мероприятиях информируют администрацию территории и вышестоящий центр Госсанэпиднадзора. При регистрации завозных, вторичных от завозных или местных случаев малярии объем противомалярийных мероприятий зависит от времени регистрации больных (в сезоне передачи или в межсезонном периоде), интенсивности передачи и должен быть согласован в каждом случае с вышестоящим центром Госсанэпиднадзора. Период проведения противомалярийных мероприятий в активном очаге трехдневной малярии должен включать 3 года ввиду наличия длительной инкубации (7 - 30 месяцев).

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Паразитологическая диагностика малярии

Дата введения 2001-01-01

1. Методические указания подготовлены сотрудниками Института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского Московской медицинской Академии им. И.М.Сеченова Минздрава России (к.м.н. Рабинович С.А., к.б.н. Кукина И.В., Mа. ская* Е.В., к.м.н. Морозов Е.Н.) и Федерального центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минздрава России (к.б.н. Цыбина Т.Н., Сыскова Т.Г.).
________________
* Брак оригинала. - Примечание изготовителя базы данных.

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 19 октября 2000 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Область применения и нормативные ссылки

Паразитологическую лабораторную диагностику малярии проводят клинико-диагностические лаборатории лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) системы Минздрава, ведомственных учреждений, а также другие лаборатории, независимо от принадлежности и форм собственности (НИИ, вузов, Минобороны, УВД, частных клиник и т.д.), имеющие лицензию и аккредитованные в системе госстандарта и госсанэпиднадзора в установленном порядке.

Органы и учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации организуют и проводят эпидемиологический надзор за малярией, частью которого является:

контроль за уровнем лабораторной диагностики малярии в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и других ведомств (в т.ч. исследования: 1) контрольные - не менее 10% препаратов крови, от числа отрицательных; 2) обязательные - 100% сомнительных и положительных препаратов крови с целью подтверждения лабораторного диагноза малярии);

обследование населения в очагах малярии, обследование населения по эпидпоказаниям и с консультативной целью.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативно-методические и правовые документы.

Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (30 марта 1999, N 52-ФЗ).

"Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" (22 июля 1993, N 5487-1).

Санитарные правила и нормы 3.2.569-96* "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации".
_______________
* Действуют СанПиН 3.2.1333-03. - Примечание изготовителя базы данных.

Санитарные правила 3.1/3.2.558-96* "Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний".
_______________
* Действуют СП 3.1/3.2.1379-03. - Примечание изготовителя базы данных.

Санитарные правила 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности и гельминтами".

2. Общие положения

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных и местных случаев заболевания требуют своевременной лабораторной диагностики, необходимой для адекватного лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.

Малярию человека вызывают 4 вида паразитических простейших рода Plasmodium: Р. falciparum - возбудитель тропической малярии, Р. vivax - трехдневной малярии, Р. ovale - малярии типа трехдневной, Р. malariae - четырехдневной малярии. Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера: географический анамнез (пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера: лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки и ряд других - обязывают врачей лечебно-профилактических учреждений заподозрить малярию.

Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

3. Характеристика развития малярийного паразита в эритроцитах

Проявления малярии обусловлены развитием паразита в эритроците - так называемой эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии образуются бесполые и половые формы паразита.

Бесполые формы за период времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития, строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные свойства) хорошо различимы в "тонком мазке" крови. Трофозоиты - одноядерные растущие стадии: кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые. Шизонты - делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые), с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые, представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с обособленными ядрами и цитоплазмой. В динамике эритроцитарная шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит, внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется - кольцевидный трофозоит. На этой стадии цитоплазма имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки. По мере роста паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся по форме и числу, псевдоподии - образуется амебовидный трофозоит. В дальнейшем у развивающегося трофозоита постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и количество цитоплазмы - образуется зрелый трофозоит. Зрелый трофозоит - округлая или несколько вытянутая клетка с относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита. Затем наступает стадия шизонта, начинается попарное деление ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь вокруг каждого из дочерних ядер - образуется зрелый шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для каждого вида плазмодиев (см. таблицы). При отсутствии или неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты, и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев продолжительностью развития одной генерации. У Р. falciparum, P. vivax, P. ovale - 48 ч, Р. malariae - 72 ч.

В процессе роста паразита в его цитоплазме появляется малярийный пигмент - продукт метаболизма гемоглобина, представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от золотисто-коричневого до черного цвета. Количество пигмента, размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются по мере его перехода в последовательные стадии развития.

У части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются в половые формы, гаметоциты - женские (макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты). Мужские и женские гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли, характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом. Округлая форма присуща гаметоцитам Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) - Р. falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем бесполых форм. При этом женских гаметоцитов в 3-5 раз больше, чем мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты Р. vivax, Р. ovale, P. malariae значительно отличаются от гаметоцитов Р. falciparum по срокам созревания, появления в периферической крови и сохранения способности заражать переносчика (самок комара Р. anopheles).

Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae развиваются в эритроцитах, циркулирующих в периферической крови. Развитие Р. falciparum происходит в синусах селезенки и мелких капиллярах внутренних органов в связи с адгезией пораженных эритроцитов к стенкам таких капилляров. В периферической крови обнаруживаются, преимущественно при неосложненном течении, только самые молодые стадии - кольцевидные трофозоиты. Их число очень быстро нарастает, поэтому при однократном исследовании периферической крови в начале болезни можно получить неправильное представление об истинном числе паразитов. При осложненном течении в периферической крови могут быть обнаружены более зрелые возрастные стадии паразита и гаметоциты в связи с нарушением сосудистого тонуса.

При оценке результатов исследования препаратов крови, наряду с типичной морфологией возбудителя, необходимо учитывать ряд особенностей, характеризующих паразитологическое развитие инфекции собственно и привходящих воздействий (предшествовавшее применение противомалярийных препаратов, неправильное приготовление и окраска препаратов крови).

4. Принцип метода паразитологической диагностики малярии

Паразитологическая диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно только в период его развития в эритроците. Для обнаружения плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом "тонкого мазка" и "толстой капли", окрашенные по Романовскому-Гимза. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.

Основной метод - "толстая капля". Благодаря распределению относительно большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30-40 раз большее, чем в "тонком мазке", что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии. Начинать надо всегда с просмотра "толстой капли".

Чувствительность метода "толстой капли" такова, что при просмотре 100-150 полей зрения можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови. Концентрация исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы, "толстую каплю" окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации. Несмотря на определенную специфичность, такая деформация иногда может препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром "толстой капли" можно только, если вид паразита был первоначально установлен. "Толстая капля" относительно быстро позволяет выявить и других паразитов крови: трипаносом, микрофилярий, спирохет, бабезий и др. Отрицательный паразитологический результат изучения "толстой капли", но повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов позволяет предположить перенесенную недавно малярию (при отсутствии соответствующих анамнестических данных), обнаружение повышенного содержания лейкоцитов, их видовой состав, а также повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов, позволяют предположить иное заболевание, не связанное с малярией.

В "тонком мазке", фиксированном до окраски, сохраняются морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и присущие данному виду паразита. Большое значение для дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных эритроцитов. "Тонкий мазок" крови делают в дополнение к "толстой капле". В тех случаях, когда вид возбудителя в очаге установлен, для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом "толстой капли".

5. Необходимые реактивы и оборудование

1. Этиловый спирт 96°.

2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска).

3. Метиленовый синий.

4. Этиловый эфир.

6. Тетраборат натрия (бура).

7. Калий фосфат однозамещенный безводный - KH PO .

Проблема малярии в настоящее время актуальна для различных регионов мира: заболевание распространено более чем в 90 странах, где проживают около 36 % человечества. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно малярией заболевают от 300 до 500 млн человек, из них от 1,5 до 2,5 млн погибают, среди которых 90 % — дети младшего возраста. Перенесенное заболевание не оставляет стойкого иммунитета даже к тому виду паразита, которым оно было вызвано.

В Российской Федерации заболеваемость малярией обусловлена завозными случаями, иногда вторичными от завозных, ежегодно наблюдаются летальные исходы тропической малярии. Серьезной проблемой для многих стран, в т. ч. для России, является так называемая аэропортная малярия, возникающая вследствие заражения посредством комаров, привезенных самолетами из эндемичных по малярии регионов.

Малярией[4] называют группу антропонозных протозойных трансмиссивных заболеваний человека, возбудители которых передаются комарами рода Anopheles. Известны четыре вида плазмодиев — возбудителей малярии человека:

Plasmodiumvivax — возбудитель трехдневной малярии;
Plasmodiumfalciparum — возбудитель тропической малярии;
Plasmodiummalariae — возбудитель четырехдневной малярии;
Plasmodiumovale — возбудитель овале-малярии трехдневного типа.

Между четырьмя видовыми формами малярии человека существуют различия в клинической картине, диагностике, эпидемиологии и профилактике. Они определяются особенностями жизненных циклов плазмодиев. Общим является то, что развитие малярийных плазмодиев происходит поочередно в организмах двух хозяев — комаров рода Anopheles и человека.

Клиническая картина малярии характеризуется периодическими лихорадочными приступами, анемией, увеличением селезенки и печени. Несмотря на многовековую практику, поставить дифференциальный диагноз на ранних стадиях весьма сложно, т. к. ведущим симптомом начала болезни является лихорадка, присущая большинству инфекционных заболеваний. В МУ 3.2.1756-03 и других нормативных актах, регламентирующих санитарно-эпидемиологический надзор за малярией, в качестве важного звена профилактики на низкоэндемичных территориях, таких как Россия, определено активное выявление и лечение больных малярией и паразитоносителей. Так, согласно п. 5.8 СанПиН 3.2.3215-14 обследованию на малярию подлежат:

лица, прибывшие из эндемичных по малярии местностей или посетившие эндемичные страны в течение последних 3 лет, при повышении температуры, с любым из следующих симптомов на фоне температуры тела выше 37 °C: недомогание, головная боль, увеличение печени, селезенки, желтушность склер и кожных покровов, герпес, анемия;
лица с неустановленным диагнозом, лихорадящие в течение 5 дней;
больные с установленным диагнозом, но с продолжающимися периодическими подъемами температуры, несмотря на проводимое специфическое лечение;
лица, проживающие в активном очаге, при любом повышении температуры.

В диагностике малярии важная роль принадлежит именно лабораторному исследованию крови. За последние 5–10 лет лабораторная диагностика малярии пополнилась многими современными методами. Среди них иммунологические реакции (непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохроматографический тест (ИХТ)), флюоресцентная микроскопия и полимеразная цепная реакция (ПЦР). У каждого из новых методов есть преимущества перед классической микроскопией: простота и быстрота в исполнении, высокие чувствительность и специфичность, оперативное обучение персонала даже без медицинского образования, использование для массовых обследований, ретроспективной эпидемиологической диагностики. Однако все новые методы имеют недостатки, которые пока ограничивают круг их применения. Так, например, для проведения НРИФ необходим флюоресцентный микроскоп, для ИФА требуется стандартизация антигена плазмодиев, ИХТ определяет в крови пока только антиген Plasmodium falciparum, флюоресцентная микроскопия является дорогостоящим методом, который к тому же не позволяет идентифицировать плазмодии до вида, применение ПЦР также связано с ощутимыми затратами. Существенным недостатком всех новых методов является невозможность или затруднения при определении интенсивности паразитемии, что необходимо для оценки тяжести течения заболевания и контроля за эффективностью лечения.

Исследование крови на малярию классическим методом — сложный и ответственный процесс. Для его успешного выполнения от лабораторного персонала требуется точное знание методики и постоянное совершенствование навыков. Нарушения, допущенные на любом этапе метода, могут привести к получению непригодных для диагностики препаратов крови, исследование станет невозможным или будет недостоверным. В связи с этим органы Роспотребнадзора осуществляют постоянный контроль качества паразитологической диагностики малярии. Каждая лаборатория направляет для оценки все положительные, сомнительные и 10 % отрицательных препаратов крови на малярию в центральный испытательный лабораторный центр управления Роспотребнадзора в субъекте федерации.

Оценка качества диагностики малярии проводится следующим образом.

1 этап — регистрация и визуальная оценка по нижеперечисленным критериям:

2 этап — контрольная микроскопия. Оцениваются:

3 этап — оформление заключения, которое содержит:

перечень установленных дефектов по каждой пробе;
определение категории качества препарата (соответствует требованиям методики, условно-пригоден, непригоден для диагностики малярии);
результат паразитологического исследования пробы.

Вашему вниманию будет представлен анализ качества препаратов для диагностики малярии за 2008–2013 гг. Речь идет о 797 пробах, которые были направлены на контроль из более чем 70 лечебно-профилактических организаций (ЛПО) Самарской области и их подразделений. Подробнее в табл. 1.

Таблица 1. Количество препаратов, представленных на контроль

Приготовление мазка и толстой капли крови при малярии.Основной метод лабораторной диагностики малярии - обнаружение эритроцитарных паразитов в толстой капле или мазке крови. В практической работе исследуют преимущественно толстые капли, так как за один и тот же промежуток времени в толстой капле можно просмотреть в 30 - 50 раз больший объем крови, чем в мазке, следовательно, и количество плазмодиев в ней больше. К мазку обращаются лишь в тех случаях, когда видовую принадлежность найденных паразитов по толстой капле установить не удается. Для выявления возбудителей малярии кровь берут при первом же подозрении на эту инфекцию независимо от температуры тела, поскольку паразиты циркулируют в крови и в интервале между приступами.

Предметные стекла, на которых готовят препараты, должны быть хорошо вымыты и обезжирены. Кровь берется с соблюдением правил асептики. Кожу пальца протирают спиртом и прокалывают простерилизованной иглой-копьем или толстой инъекционной иглой. Если кровь из мякоти пальца вытекает плохо, то больного просят сделать несколько энергичных движений рукой, кистью и слегка массируют палец. Первую выступившую каплю крови вытирают сухой ватой, затем палец поворачивают проколом вниз и ко второй капле прикасаются предметным стеклом.

Тонкие мазки крови приготавливают по методике, общепринятой для гематологических исследований. Мазок не должен доходить ни до конца, ни до краев предметного стекла. Поэтому капля крови должна быть диаметром не более 2 - 3 мм. Предметное шлифованное стекло, которым делается мазок, должно быть уже стекла, на которое наносят мазок. Для этого углы шлифованного стекла обламывают пинцетом. В целях приготовления мазка шлифованное стекло ставят перед каплей крови под углом 45° и продвигают вперед до соприкосновения с ней. Когда кровь равномерно распределится между обоими стеклами, быстрым движением делают мазок.

Для приготовления толстой капли крови на предметное стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм. Эту каплю размазывают иглой или углом предметного стекла в диск диаметром 10 - 15 мм. Толщина капли должна быть такой, чтобы сквозь нее можно было читать газетный шрифт Мазки не должны быть толстыми, поскольку после высыхания они растрескиваются и отстают от стекла. Обычно на стекло наносят 2 - 3 капли на некотором расстоянии одна от другой. Взятые капли должны быть отмечены. На обратной стороне стекла восковым карандашом указывается фамилия больного или соответствующий регистрационный номер.

Очень удобно наносить толстую каплю на влажный толстый мазок крови. В этом случае капля самостоятельно растекается в правильный диск. Простым карандашом на мазке делается маркировка препарата Такой препарат удобен еще и тем, что в мазке довольно хорошо сохраняется часть пораженных эритроцитов, а это важно для уточнения вида паразита. Преимущество данного метода в том, что капля, нанесенная на мазок, удерживается более прочно, чем нанесенная непосредственно на стекло.

Приготовленные толстые капли высушивают при комнатной температуре не менее 2 - 3 ч без какого-либо дополнительного подогревания во избежание фиксации крови. После высыхания капли на нее наливают краску Романовского - Гимзы, разведенную как обычно (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). Продолжительность окраски в среднем составляет 30 - 45 мин. Окрашенную каплю осторожно ополаскивают водопроводной водой (сильная струя может смыть каплю) и просушивают в вертикальном положении. Фильтровальной бумагой ее высушивать нельзя. При окраске капли в водных растворах красок происходит выщелачивание гемоглобина из эритроцитов, вследствие чего в окрашенной капле эритроциты уже не видны. Из форменных элементов сохраняются лейкоциты и тромбоциты.

Мазки фиксируют, помещая их на 3 мин в метиловый или на 10 мин в 96% этиловый спирт. Зафиксированные препараты высушивают на воздухе, защищая от пыли и мух. Потом препараты помещают в специальный контейнер и окрашивают азур-эозиновым красителем по Романовскому - Гимзе на протяжении 20 - 30 мин.

По истечении этого срока контейнер подставляют под слабую струю воды и промывают. После того как из контейнера польется неокрашенная вода, остатки ее сливают и промывают еще раз. Не рекомендуется сначала сливать краску, а затем промывать мазок водой, поскольку пленка, образовавшаяся на поверхности красителя, может попасть на препараты и оказаться причиной диагностической ошибки. Капля на мазке окрашивается так же, как толстая капля.

Промытые препараты высушивают и исследуют под микроскопом. В зараженных эритроцитах видны плазмодии малярии с голубой цитоплазмой и ярко-красным ядром. Нахождение плазмодиев малярии в крови больного является неоспоримым доказательством болезни.

Определение интенсивности паразитемии при малярии. Достаточно точный метод сводится к подсчету среднего числа паразитов на одно поле зрения толстой капли. Если паразитов много, то подсчет ведут в 10 полях зрения, если мало в 100. Численность указывают отдельно для обнаруженных стадий паразита, например, р. falciparum кольца +++, гаметоциты +. Применительно к численности колец ВОЗ рекомендованы следующие символы:

1 – 10 в 100 п. зр = +.

более 10 в п. зр. = + + ++

более 100 в п.зр.=+ + + + +

Лаборанты с высоким уровнем подготовки применяют более точный метод, а именно, подсчитывают численность паразитов по отношению к числу лейкоцитов. Например, в толстой кишке на 100 лейкоцитов найдено 20 паразитов.

Допуская, что у больного 4.000 лейкоцитов в 1 мкл крови, легко установить:

в исследованных полях зрения – 100 лейкоцитов и 20 паразитов в 1 мкл имеется 4000 лейкоцитов и Х паразитов. Следовательно, в 1 мкл: 4000х20/100 = 800 паразитов. Подсчет будет еще более точным, если в формулу ввести конкретное, а не предположительное число лейкоцитов у данного пациента. При очень высокой паразитемии ее интенсивность может быть охарактеризована числом паразитов на 100 эритроцитов, подсчитанных в тонком мазке.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Читайте также: